免疫荧光染色是实验室常用的技术之一，但在操作过程中，有许多需要注意的细节，任何一个环节的失误都可能导致实验失败。本文将为您介绍免疫荧光染色的注意事项。

1. 抗体选择：选择针对您研究的目标蛋白特异性高、亲和力强的抗体，一抗的浓度需要预实验摸索。一抗浓度过高(本身荧光实验，一抗的浓度就较高)，也是造成自发荧光强的重要原因。

2. 抗体稀释：根据抗体说明书建议，使用合适的稀释液和稀释比例进行抗体稀释。

3. Blocking：使用合适的Blocking 液进行Blocking 处理，以减少非特异性结合，一般采用动物血清，在室温下封闭1h左右。建议适当延长封闭的时间至2h。如果室温较低，可以考虑采用37℃孵育箱进行封闭，优化封闭时间，充分去除组织中的类属抗原。

4. 二抗选择：选择与一抗种属匹配的荧光标记二抗，二抗在4℃长时间放置后可能有部分荧光素沉淀，导致染色结果有星星点点的杂质，损失珍贵样本！建议配成工作液后，高速离心，取上清使用。

5. 洗涤：在每一步操作后，充分洗涤以去除未结合的抗体和染料。

6. 封片：选择合适的封片剂进行封片，避免荧光淬灭。

7. 对照设置：设置合适的阳性和阴性对照，以确保实验结果的可靠性。

封片技巧：

在滴加封片剂之前，确保切片上没有多余的液体。封片剂也不宜添加过多，可用10ul枪头吸取少量，点在每个样品边缘，缓慢盖片。

滴加适量的封片剂，避免产生气泡。

用10ul枪头滴加~5ul/样品（根据组化笔大小 酌情更改封片剂滴加量） 千万不可打出气泡！不要把枪头最后一滴封片剂打出！气泡会严重影响封片效果！

如果不小心产生气泡 → 可以用镊子轻轻将气泡挤出。

使用干净的盖玻片，轻轻按压，使封片剂均匀覆盖切片。

避免在盖玻片上留下指纹或污渍。

希望 这些技巧能帮助您顺利完成实验。