1.样本的准备：尽量使用新鲜样本，不使用有溶血，被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全的样本。ELISA检测宜采集新鲜标本，如不能立即测定，5天之内应4℃保存，对于1周后检测的样本应低温冻存；做好分装，长时间冻存的样本避免反复冻融。

2.仔细阅读说明书，熟悉整个流程，推荐画出简要步骤图；提前准备试剂，比如常见20X洗涤液是浓缩液，需要用超纯水提前稀释准备好。一般的检测抗体和酶标二抗需要用对应的稀释液稀释至工作浓度。

3.不同批次的试剂不要混用，检查各组分的有效期。

4.预包被的酶标板条和各试剂组份需要室温平衡30 min以上，这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需温度，预防后续实验中由于孵育温度或是时间不够充分，而将一些弱阳性样本不能检出。

5.待测样本加样：待检样本过多时，建议分批操作；需要稀释的样本提前做好稀释，注意选对合适稀释液；控制好加样时间，避免加样费时过长造成误差；注意加样角度，垂直加入孔底，不要接触孔壁, 做到一份样本一个移液头，防止交叉污染。

6.温育和洗板：温育时间和温度一般根据试剂盒的说明书进行选择。温育时可以采用水浴或者湿盒孵育,避免“边缘效应"。①手工洗板时，拍板时要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离；②洗板机洗板时应经常检查冲洗头是否通畅。

7.显色：市售ELISA 试剂盒中，一般是以四甲基联苯胺(TMB)为底物的显色液，反应条件为37℃或室温反应15～30 min。显色反应需要避光。

8.读数和数据分析：终止后读取结果尽量在15min内完成，读取OD值时酶标仪需先预热15～30 min再进行。数据分析一般用四参数和直线拟合法，选择哪种拟合方式，可以依据标曲的相关系数（R2）来确定，R2一般需要大于0.99。